Глава 7. Методы исследования белков

7.2. Методы зонального разделения

 

Эти методы основаны на том, что создается некоторая система, в которой компоненты смеси перемещаются с различными скоростями. Если в такую систему ввести разделяемую смесь в виде некоторой зоны, то по мере ее перемещения компоненты смеси, движущиеся с разными скоростями, будут формировать отдельные зоны, которые затем можно разнести в разные приемники.

1) Хроматография. При разделении белков и их анализе используется жидкостная хроматография. В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ с помощью тока элюирующей (вымывающей) жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам. При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона с разделяемой смесью.

В зависимости от природы физико-химического явления, лежащего в основе разделения веществ, различают адсорбционную, ионообменную, распределительную и гель-хроматографию (эксклюзивную хроматографию). В адсорбционной чаще всего используют оксид алюминия в качестве неподвижной фазы. В ионообменной используются те же типы ионитов, что в ионообменной сорбции. Распределительная хроматогрфия основана на разделении веществ между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Неподвижная жидкая фаза образуется в результате ее закрепления на пористом нерастворимом носителе.

2) Электрофорез. В этом случае зоны создаются в результате того, что разные компоненты смеси с различной скоростью перемещаются в электрическом поле. После специальной обработки разделяемые смеси наносят на гель (декстроновый, полиакриламидный, или другой) а затем подключают но определенное время постоянный электрический ток. Белки в зависимости от своей молекулярной массы и заряда начинают двигаться с различной скоростью. После отключения тока гель помещают в специальный раствор, где интересующие исследователя белки окрашиваются. Существует электрофорез в растворе, но он имеет ограниченное применение, т.к. исследуемые белки часто подвергаются значительному диффузионному размыванию. Однако сейчас стало возможным применять этот метод в условиях невесомости в космосе, что устраняет конвекционные токи, обуславливающие диффузионную размывку.

Все описанные выше методы зонального разделения являются одномерными, разделение в них происходит в одной координате. Наряду с этим применяются двумерные системы разделения на пластинах. При этом разделяемую смесь в виде пятна наносят на один из углов и разделяют в одном направлении. Затем какие-либо параметры, определяющие разделяющую способность системы изменяют и проводят разделение в перпендикулярном направлении. При удачном подборе системы и условий разделения удается разделить те компоненты, которые не разделились при первой процедуре. Комбинации методов могут быть довольно разнообразны: двумерная хроматография с использованием в разных направлениях разных элюентов, хроматография в одном и электрофорез в другом направлениях.